Ląstelių kultūra yra viena iš svarbiausių priemonių, naudojamų ląstelių ir molekulinėje biologijoje, suteikianti puikią modelio sistemą tiriant normalią fiziologiją ir biochemiją (pvz., medžiagų apykaitos tyrimus, senėjimą), vaistų ir toksinių junginių poveikį ląstelėms. ląstelių mutagenezės ir kancerogenezės. Jis taip pat naudojamas vaistų patikrai ir kūrimui bei didelio masto biologinių junginių (pvz., vakcinų, gydomųjų baltymų) gamyboje. Pagrindinis privalumas naudojant ląstelių kultūrą bet kuriai iš šių programų yra rezultatų, kuriuos galima gauti naudojant kloninių ląstelių partiją, nuoseklumas ir atkuriamumas.
ląstelių kultūros
Ląstelių kultūra – tai ląstelių pašalinimas iš gyvūnų ar augalų ir jų augimas palankioje dirbtinėje aplinkoje. Ląstelės gali būti pašalintos tiesiai iš audinio ir atskirtos fermentiniu arba mechaniškai prieš kultūrą, arba jos gali būti gautos iš nusistovėjusių ląstelių linijų ar padermių.
1. Pradinis mokymas
Pirminė kultūra reiškia kultūros stadiją po to, kai ląstelės buvo išskirtos iš audinio ir padaugintos atitinkamomis sąlygomis, kol jos užima visą turimą substratą (ty pasiekia susiliejimą). Šiame etape ląstelės turi būti subkultūros (ty persodinamos), perkeliant jas į naują talpyklą su šviežia auginimo terpe, kad būtų daugiau vietos tolesniam augimui.
2. Ląstelių linijos
Po pirmosios subkultūros pirminės kultūros vadinamos ląstelių linijomis arba subklonais. Ląstelių linijos, gautos iš pirminių kultūrų, turi ribotą gyvenimo trukmę (ty jos yra baigtinės), o kai jos yra pasuotos, vyrauja ląstelės, turinčios didžiausią augimo potencialą, todėl populiacijos lyties genotipinis ir fenotipinis vienodumas.
3. Ląstelių linijos
Ląstelių linija tampa ląstelių štamu, jei iš kultūros klonavimo ar kitais metodais aktyviai atrenkama ląstelių linijos subpopuliacija. Ląstelių linijos dažnai įgyja papildomų genetinių pokyčių po to, kai buvo pradėta tėvų linija.
4. Ribotos ląstelių linijos ir ištisinės ląstelių linijos
Normalios ląstelės paprastai dalijasi tik ribotą skaičių kartų, kol praranda gebėjimą daugintis – tai genetiškai nulemtas įvykis, vadinamas senėjimu; šios ląstelių linijos vadinamos baigtinėmis. Tačiau kai kurios ląstelių linijos tampa nemirtingos per procesą, vadinamą transformacija, kuri gali įvykti spontaniškai arba būti sukelta cheminiu ar virusiniu būdu. Baigtinė ląstelių linija tampa ištisine ląstelių linija, kai ji transformuojasi ir įgyja galimybę neribotai dalytis.
Nuolat kultivuojamos ląstelių linijos yra linkusios į genetinį dreifą, baigtinės ląstelių linijos yra pasmerktos senti, visos ląstelių kultūros yra jautrios mikrobiniam užteršimui, o įranga gali sugesti net ir geriausiai valdomose laboratorijose. Kadangi nusistovėjusios ląstelių linijos yra vertingas išteklius, kurio pakeitimas kainuoja brangiai ir užima daug laiko, labai svarbu jas užšaldyti ilgalaikiam saugojimui.
Kai iš subkultūros gaunamas nedidelis likusių ląstelių skaičius, jas reikia užšaldyti kaip sėklą ir apsaugoti nuo bendro naudojimo laboratorijoje. Darbines atsargas galima paruošti ir papildyti iš šaldytų sėklų atsargų. Jei sėklų atsargos yra išeikvotos, šaltai konservuotas darbinis žaliavas gali būti naudojamas kaip šaltinis ruošiant šviežias sėklų atsargas, o nuo pradinio užšaldymo gaunamas minimalus kiekis.
Geriausias būdas išaugintas ląsteles užšaldyti yra skystame azote, pilnoje terpėje, esant šalčiui apsaugančių medžiagų, tokių kaip dimetilsulfoksidas (DMSO) arba glicerolis. Krioprotektoriai sumažina terpės užšalimo temperatūrą ir taip pat sumažina aušinimo greitį, todėl labai sumažėja ledo kristalų susidarymo rizika, kuri gali pažeisti ląsteles ir sukelti ląstelių mirtį.
Yra žinoma, kad DMSO palengvina organinių molekulių patekimą į audinius. Dirbant su reagentais, kurių sudėtyje yra dimetilsulfoksido, turi būti naudojama įranga ir praktika, atitinkanti šios medžiagos keliamus pavojus. Išmeskite reagentus pagal vietines taisykles.
Auginkite ląsteles iš užšaldytų darbinių ląstelių atsargų
Būtinai užpildykite mobiliosios bankininkystės žurnalą
Nustatykite pasažų skaičių, pvz., jei ankstesnės ląstelės buvo užšaldytos ir jos buvo atšildytos tris kartus, atšildymo procesas būtų ketvirtas.
Įpilkite augimo terpės (minimalios terpės, veršelių serumo ir antibiotikų) į T75 kolbas, pažymėtas ląstelių linija, pasėjimo numeriu ir data.
Įdėkite kolbą horizontaliai į CO inkubatorių 37 laipsnių ir 5 procentų CO bent 15 min. Tai sušildys terpę ir padidins jos normalų pH (7.{4}}.6).
Užšaldytus buteliukus su ląstelių linijomis atšildykite 37 laipsnių vandens vonioje, švelniai maišydami. Kad sumažintumėte užteršimo riziką, sandarinimo žiedą ir dangtelį laikykite aukščiau vandens lygio (2-5 min.).
Įdėkite buteliuką į biologinės saugos spintelę (BSL{0}}). Kad išvengtumėte užteršimo, prieš atidarydami buteliuką nuvalykite 70 procentų etanoliu.
Sušaldytos ląstelių kolbos turinys perkeliamas į T75 kolbą, kurioje yra auginimo terpė. Sumaišykite ir švelniai purtykite kolbą, kad ląstelės tolygiai pasiskirstytų ant kolbos paviršiaus.
Inkubuokite kolbą per naktį CO2 inkubatoriuje 37 laipsnių temperatūroje su 5 procentais CO2. Leiskite ląstelėms prisitvirtinti per naktį
besikeičianti augimo terpė
Inkubuokite kolbą dar 2-4 dienas 37 laipsnių temperatūroje, 5 proc. CO2 ir stebėkite, kol ląstelės augs
Kai ląstelės pasiekia maždaug 90 procentų susiliejimo, ląstelių atsargas galima išplėsti naudojant T150 kolbą
