Įprastoms rinkoje esančioms Petri lėkštelėms su stikliniu dugnu plastikinės Petri lėkštelės apačioje paprastai padaroma skylė, o tada prie lėkštelės dugno priklijuojamas dangtelis arba stiklinis stiklelis, kurio storis yra 170-220 μm. Petri lėkštelė su bešešėliu klijais arba silikageliu. Ne visas Petri lėkštelės dugnas pagamintas iš stiklo. Stebėjimui tinkama sritis yra tik perforacijos srityje. Tačiau dėl stiklo hidrofobiškumo, kultivuojant ląsteles, ląstelės negali gerai prilipti prie stiklo, o augimo būsena nėra gera, o atliekant konfokalinio skenavimo vaizdavimą atsiranda net ląstelių delaminacijos reiškinys.
Kad ląstelės gerai priliptų, prieš naudojant stiklinius indus ląstelių kultūrai, būtina patvirtinti, kad buvo padengti specifiniai baltymų reagentai.
„pasidaryk pats“ antklodė
Skirtingoms ląstelių kultūroms reikalingi skirtingi dengimo reagentai. Tuo pačiu, kadangi dengimui naudojamas baltymas yra biologinis produktas, skirtingų firmų gaminio grynumas ir dengiamojo baltymo dozės skiriasi. Šis techninis įrašas skirtas tik nuorodai. Konkreti dengimo reagentų dozė turėtų būti nurodyta naudojamų prekių ženklų instrukcijose. . Ir geriausia atlikti gradiento eksperimentą su naudojamais reagentais, kad rastumėte tinkamiausią dangos koncentraciją.
Štai poli-L-lizino (PLL, sigma, P4832, 100 ug/ml) pavyzdys:
PLL danga tinka daugumai ląstelių, ypač neuronų kultūrai centrinėje sistemoje. Būtina, kad baltymų kiekis (ug/cm2) ploto vienete pasiektų pageidaujamą kiekį naudojimo metu. Šiame pavyzdyje rekomenduojamas PLL dangos kiekis yra 2 ug/cm2. Reikia apskaičiuoti reikiamą baltymų kiekį pagal dengimo plotą ir dangos tūrį.
Pavyzdžiui: 35 mm stiklinio dugno Petri lėkštelė, ląstelių augimo plotas 3,5 cm2, dangos plotas 4,1 cm2, o dengimo tirpalo tūris yra 400 ul, tada rekomenduojama dozė yra 2 ug/cm2. Tada viename šulinyje reikia 8,2 ug PLL. Jei įpilama tik 400 ul PLL tirpalo, PLL tirpalo koncentracija yra 20,5 ug/ml (apie 20 ug/ml). Todėl pradinį tirpalą reikia atskiesti itin grynu vandeniu.
Konkretūs veiksmai:
1. Atskieskite PLL pradinį tirpalą 1:5 itin grynu vandeniu.
2. Į kiekvieną 35 mm stiklinį dugną Petri lėkštelę įpilkite 400 ul PLL skiedimo.
3. Inkubuokite 1-2 valandas kambario temperatūroje ir išsiurbkite PLL skiedimą.
4. Atsargiai nuplaukite 3 kartus 2 ml PBS tirpalo arba terpės be serumo ir išsiurbkite plovimo tirpalą.
5. Tiesiogiai įpilkite ląstelių suspensijos auginimui.
Metodo įvertinimas
Dėl skirtingų dengiančių baltymų savybių skirtingi dengiamieji baltymai naudojami skirtingai. Naujas užterštumas dažnai susidaro dėl būtinybės padengti stiklinius indus. Be to, užterštumas dažnai aptinkamas pakėlus ląsteles, o tai ne tik uždelsia laiką, bet ir eikvoja rinkinio eksploatacines medžiagas. Juk dengti baltyminiai reagentai ir kokybiški indai su stikliniu dugnu yra brangūs (prastos kokybės stikliniai indai gali nutekėti, nes klijai nėra lipnūs arba naudojami klijai yra toksiški ląstelėms).
Konfokalinės Petri lėkštelės be dangos
Vaikams, norintiems sutaupyti laiko ir pastangų, patogiau naudoti konfokalinės kultūros indus be dangos.
Renkantis tinkamą kultivavimo indelį reikia atsižvelgti į šiuos veiksnius: ar jis tinkamas jūsų ląstelėms prilipti, ar kultivavimo lėkštelės optinės charakteristikos atitinka konfokalinius reikalavimus.
Petri lėkštelės, atitinkančios aukščiau nurodytų veiksnių reikalavimus, neapsiriboja lėkštelėmis su stikliniu dugnu. Tiesą sakant, visi žino, kad plastikiniai indai yra pigesni ir lengviau ląstelėms prilimpa, nei stikliniai. Pateikiame konfokalinės kultūros patiekalo iš Šanchajaus Jingan pavyzdį, kad pakalbėtume apie parametrus, kuriuos turi turėti kultūrinis patiekalas, tinkamas konfokaliniams eksperimentams:
Matyti, kad tiesioginio naudojimo reikalavimus atitinkančių konfokalinės kultūros indelių fizikiniai parametrai yra labai artimi stiklui, tačiau kartu pasižymi ir hidrofilinėmis savybėmis, dėl kurių dauguma ląstelių gali geriau sukibti; ir lankstumas yra geresni nei stiklo. Tai leidžia daugumai ląstelių linijų ir pirminių ląstelių tiesiogiai prilipti prie sienos ir nėra trapi, o tai yra geras pasirinkimas.
Taip pat galite rasti tinkamiausią konfokalinės kultūros indą savo eksperimentui pagal savo specifinius eksperimento reikalavimus ir aukščiau pateiktoje lentelėje nurodytus parametrus.
Metodo įvertinimas
Pasirinkus tokio tipo Petri lėkštelę nereikia papildomos dangos, o tai labai sumažina užteršimo riziką. O kadangi su plastikiniu dugnu lengviau dirbti, jo tvirtinimui prie Petri lėkštelės dugno nereikia klijų. Pašalinkite nuotėkio ar citotoksiškumo galimybę.
