PGR technologija yra panaši į natūralų DNR replikacijos procesą, o jos specifiškumas priklauso nuo oligonukleotidų pradmenų, kurie papildo abu tikslinės sekos galus. PGR susideda iš trijų pagrindinių reakcijos etapų: denatūravimo, atkaitinimo ir pratęsimo. Šis reakcijos procesas atliekamas PGR reakcijos konteineryje. Nuolat tobulinant genų amplifikacijos instrumentą, reakcijos talpyklos centrifugos mėgintuvėlis laipsniškai išaugo nuo 1,5 ml iki 0,2 ml (0,25 ml) iki plonasienio {{ 7}},2 ml, skirta PGR. , 0.1 mlpcr vamzdelis. Didėjant PGR amplifikacijos reakcijų skaičiui, palaipsniui formuojasi didelio našumo genų amplifikacijos konteineriai PGR juostelėms ir PGR plokštelėms.
PGR susideda iš trijų pagrindinių reakcijos etapų: denatūravimo-atkaitinimo-pratęsimo
Šablono DNR denatūravimas:
Kai šabloninė DNR tam tikrą laiką kaitinama iki maždaug 94 laipsnių, dvigrandė DNR šablono DNR arba dvigrandė DNR, susidariusi PGR amplifikacijos būdu, yra disocijuojama, kad ją būtų galima sujungti su pradmeniu. kitam reakcijos raundui.
Šablono DNR atkaitinimas (renatūravimas) pradmenimis:
Kai DNR šablonas denatūruojamas į vieną grandinę kaitinant, o temperatūra sumažinama iki maždaug 55 laipsnių, pradmenys suporuojami su viena DNR šablono grandinės komplementaria seka.
Gruntų pratęsimas:
Veikiant Taq, DNR šablono ir pradmenų konjugatas naudoja dNTP kaip reakcijos žaliavą, kad sintezuotų naują pusiau rezervuotą replikacijos grandinę, papildančią šablono DNR grandinę pagal bazių poravimosi ir pusiau rezervuotos replikacijos principą.
Pagrindiniai PGR technologijos principai
Ši technologija remiasi DNR polimerazės fermentine sintezės reakcija, dalyvaujant šabloninei DNR, pradmenims ir keturiems dezoksiribonukleotidams.
DNR polimerazė naudoja viengrandę DNR kaip šabloną, kad inicijuotų sintezę su nedideliu dvigrandės DNR gabalėliu. Vienas arba du sintetiniai oligonukleotidiniai pradmenys sujungiami su vienagrandės DNR šablono komplementaria seka, kad susidarytų dalinė dvigrandė DNR.
Tinkamoje temperatūroje ir aplinkoje DNR polimerazė prideda deoksimononukleotidą prie pradmens 3'-OH galo ir naudoja jį kaip pradinį tašką, kad tęstųsi šablono 5'→3' kryptimi, kad susintetintų naują DNR komplementarią grandinę.
Skirtumas tarp PGR ir centrifugos mėgintuvėlių
PGR vamzdeliai:
PGR reakcijos plokštelė yra 96-šulinėlė arba 384-šulinėlė, kuri yra specialiai sukurta periodinėms reakcijoms. Principas yra tas, kad PGR aparato ir sekvencerio pralaidumas paprastai yra 96 arba 384.
Centrifugos vamzdelis:
Centrifugos mėgintuvėlis nebūtinai yra PGR mėgintuvėlis. Pagal jų talpą yra daugybė centrifugų vamzdžių rūšių. Dažniausiai naudojami 1,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 arba 50 ml, o mažiausias (250 ul) gali būti naudojamas kaip PGR mėgintuvėlis.
Kaip pasirinkti PGR vamzdelius
Pasirinkome PGR mėgintuvėlių vietą, tikėdamiesi parinkti tiksliausią temperatūros vietą.
Tiksliausia temperatūros padėtis turėtų būti padėtis virš temperatūros jutiklio po moduliu (neatsižvelgiant į netikslią jutiklio temperatūrą).
Skirtingų PGR prietaisų temperatūros jutiklio padėtis skiriasi.
Pavyzdžiui, AB's 2720 turi tik vieną viduryje, MJ's 200 turi tris jutiklius, kurie yra apačioje kairėje, viduryje ir viršuje dešinėje, Eppendorfo turi būti A arba H eilėje, o Dongshenglong 811 turi tris temperatūros jutiklius, B{{3} } reikia pasirinkti , C1-2, C6-7, D6-7, B11-12, C11-12, nes šie taškai yra temperatūros taškai.
