Kas yra ląstelių kultūra?
ląstelių kultūros
Ląstelių kultūra reiškia ląstelių auginimo procesą kontroliuojamomis sąlygomis už jų natūralios aplinkos ribų. Tai in vitro įrankis, padedantis suprasti ląstelių biologiją ir ligų mechanizmus. Ji taip pat atlieka svarbų vaidmenį atrandant vaistus, pvz., atliekant toksiškumo tyrimus ir farmakokinetinius / farmakodinaminius tyrimus, taip pat kuriant individualizuotą mediciną.
Amerikiečių embriologas Rossas Granville'is Harrisonas sukūrė pirmuosius in vitro ląstelių kultūros metodus XX amžiaus pradžioje, kai sėkmingai išaugino audinių fragmentus iš varlių embrionų in vitro. Šiandien ląstelių kultūra padėjo padaryti daugybę atradimų, pavyzdžiui, sukurti vakcinas nuo poliomielito, tymų, kiaulytės ir kitų infekcinių ligų.
Sukibimo ir pakabos kultūra
Yra dvi pagrindinės ląstelių augimo sistemos: prilipusi kultūra ir suspensijos kultūra. Prilipusios kultūros auginamos ant dirbtinių substratų, o suspensijos kultūrose ląstelės laisvai plūduriuoja terpėje. Nors tik keli ląstelių tipai natūraliai auga suspensijoje (pvz., limfocitai), daugelis prilipusių ląstelių tipų gali būti pritaikyti suspensijos kultūrai.
Yra dvi priežastys, kodėl suspensijoje auginamos natūraliai prilipusios ląstelės. Pirmasis suspensijos kultūros privalumas yra tas, kad ląsteles lengviau pernešti, nes nereikia jų fermentiškai ar mechaniškai atskirti nuo auginimo indo. Antra, suspensines kultūras lengviau padidinti, nes ląstelių augimą riboja tik jų koncentracija terpėje, o ne turimas paviršiaus plotas. Pagrindinis suspensijos kultūrų trūkumas yra tas, kad joms reikia kasdien skaičiuoti ląstelių skaičių ir atlikti gyvybingumo tyrimus, kad būtų galima sekti augimo modelius, o prilipusias kultūras galima lengvai ištirti mikroskopu.
2D ir 3D metodai
Prilipusios kultūros dar gali būti skirstomos į 2D ir 3D kultūras. Taikant 2D programas, prilipusios ląstelės auginamos vienasluoksnėje sistemoje ant plokščio paviršiaus, pavyzdžiui, ląstelių kultūros kolboje.
ląstelių kultūros
Dėl savo paprastumo 2D technologija negali imituoti ląstelių aplinkos in vivo, kurios paprastai auga trimatėse struktūrose su sudėtinga ląstelių sąveika. Štai kodėl kai kurie eksperimentai atliekami naudojant 3D kultūras, kurios gali būti auginamos naudojant pastolių arba be pastolių technologijas.
Pastoliais pagrįsti 3D metodai paprastai apima prilipusių ląstelių auginimą hidrogelio pastoliuose. Kai kurioms reikmėms taip pat naudojamos alternatyvos, tokios kaip biokeraminiai, metaliniai arba polimeriniai pastoliai.
Sferoidams auginti naudojami be pastolių metodai vienu iš trijų skirtingų metodų:
Priverstinė plūdė: Įdėkite ląstelių suspensiją į mažai sukibusios polimeru dengtos mikroplokštelės šulinius. Tada mikroplokštelė centrifuguojama, kad ląstelės sudarytų sferoidus.
Kabantis lašas: ląstelių suspensija įpilama į pakabinamos lašo plokštės šulinukus. Kaip rodo pavadinimas, suspensija kabės ant plokštelės kaip lašeliai. Ląstelės agreguosis šių lašelių galiukuose ir sudarys sferas.
Maišymo pagrindu: ląstelių suspensija dedama į besisukantį bioreaktorių. Dėl nuolatinio maišymo ląstelės negalėjo prilipti prie sienelių, todėl susidarė sferoidai.
Ląstelių kultūros iššūkis
Nepaisant metodų ir metodų skirtumų, visi eksperimentai turi vieną bendrą bruožą: sunku užauginti reikiamą gyvų ląstelių skaičių, kad būtų gauti atkuriami rezultatai. Todėl tolesni skyriai bus skirti keturiems iššūkiams – pakartojamumui, užterštumui, įgyvendinamumui ir perėjimui prie automatizavimo.
atkuriamumas
Remiantis „Yongyue Medical“ apklausa, daugiau nei 70 procentų mokslininkų pranešė, kad jiems nepavyko atkurti kito mokslininko eksperimentų, o daugiau nei pusei nepavyko atkurti savo darbų. Atliekant ląstelių kultūros tyrimus, dauguma atkuriamumo problemų kyla dėl biologinių skirtumų tarp ląstelių perėjimo ar kartų. Kita didelė problema yra klaidingas ląstelių linijų identifikavimas, o kultūros parametrų nenuoseklumas taip pat vaidina svarbų vaidmenį.
biologinė variacija
Tokie veiksniai kaip atsitiktinės mutacijos ar transkripcijos klaidos gali turėti įtakos eksperimentų atkuriamumui kiekvieną kartą, kai ląstelė dalijasi. Norėdami to išvengti, naujo projekto pradžioje turėtumėte sukurti ląstelių banką.
ląstelių bankas
Ląstelių bankininkystė reiškia tam tikrų ląstelių tipų partijų saugojimo procesą, kad būtų galima vėliau naudoti, siekiant išvengti tokių veiksnių kaip atsitiktinės mutacijos ar transkripcijos klaidos, turinčios įtakos atkuriamumui. Pirmasis žingsnis yra sukurti pagrindinį ląstelių banką (MBC), auginant pasirinktus dominančius ląstelių tipus ir išsaugant jas keliuose konteineriuose. MBC partijos atšildomos ir vėliau naudojamos darbo ląstelių bankams (WBC) paruošti.
Klaidingas ląstelių linijų identifikavimas
Ląstelių linijos klaidingo identifikavimo problema buvo žinoma nuo septintojo dešimtmečio, kai mokslininkas aprašė 19 kitų žmogaus ląstelių linijų HeLa ląstelių užteršimą. Norėdami užtikrinti, kad jūsų rezultatai būtų patikimi ir, dar svarbiau, kad nepadarytumėte klaidingų išvadų, visas naujas į laboratoriją patenkančias ląstelių linijas turėtumėte karantinuoti, kol bus patikrinta jų kilmė. Svarbiausia, kad prieš kriokonservavimą ir paskirstymą kitoms laboratorijoms bei užbaigus projektą rekomenduojama pakartoti ląstelių linijos kvalifikaciją. Norėdami patikrinti ląstelių liniją, pirmiausia turėtumėte patikrinti, ar ji įtraukta į klaidingai identifikuotų ląstelių linijų registrą. Jei jis neužregistruotas, vis tiek turite patvirtinti jo autentiškumą. Žmogaus ląstelių linijoms rekomenduojama atlikti trumpą tandem kartotinę (STR) analizę (DNR pirštų atspaudų ėmimą). Galimi įvairūs nežmoginių ląstelių linijų tyrimo metodai, įskaitant kariotipų nustatymą, izofermentų analizę ir mitochondrijų DNR tipavimą (DNR brūkšninį kodavimą).
Kultūros parametrai
Trečias veiksnys, turintis įtakos atkuriamumui, yra kultūros parametrai.
Pavyzdžiui, deguonies lygis gali labai paveikti auginamas ląsteles. Tačiau kintamieji, turintys įtakos deguonies tiekimui, tokie kaip kameros dydis ar ląstelių tankis, ne visada yra dokumentuojami, todėl negali būti nuoseklūs.
Kitas svarbus kultūros parametras yra terpė. Tai suteikia būtinų maistinių medžiagų, augimo faktorių ir hormonų bei reguliuoja pH ir osmosinį slėgį. Todėl svarbiausia, kad jo sudėtis visada būtų vienoda. Tai ypač svarbu vidutinėms formulėms, papildytoms galvijų vaisiaus serumu (FBS), kurių sudėtis priklauso nuo tokių veiksnių kaip karvės dieta, geografinė padėtis ir metų laikas. Norėdami sumažinti FBS poveikį rezultatų atkuriamumui, turėtumėte užsisakyti skirtingas serumo partijas, kai dabartinės atsargos pradeda baigtis, ir išbandyti jas, kad rastumėte artimiausią atitiktį. Kad kiti galėtų atkurti jūsų rezultatus, turėtumėte pranešti, kaip tikrinote serumą, ir įrašyti partijos numerį.
ląstelių kultūros
Ląstelių apdorojimas
Dauguma tyrinėtojų žino, kad kultūros parametrai turi didžiulę įtaką jų taikymui, tačiau dažnai nepaisoma apdorojimo metodų pokyčių.
Tarša
Kai ląstelės yra išskiriamos iš audinių ir auginamos laboratorijoje, jų nebeapsaugo imuninė sistema, todėl jos yra labai pažeidžiamos užteršimo.
Pirmasis užteršimo šaltinis yra abiotiniai teršalai, tokie kaip priemaišos auginimo terpėje, serume, papilduose ar vandenyje, taip pat endotoksinai ir išplaunamos medžiagos. Atsargumo priemonės apima laboratorinio vandens naudojimą ląstelių kultūros eksperimentams ir terpę, serumą, papildus ir vartojimo reikmenis iš gamintojų, kurie siūlo endotoksinų tyrimų sertifikatus. Be to, eksploatacinės medžiagos turi būti pagamintos iš gryno polistireno arba polipropileno, kad plastikiniai priedai nepatektų į jūsų ląstelių kultūrą.
Antrasis taršos šaltinis yra biologiniai teršalai, tokie kaip bakterijos (įskaitant mikoplazmą), grybeliai ir mielės.
galimumas
Ląstelių gyvybingumas apibrėžiamas kaip gyvybingų ląstelių dalis mėginyje. Be teršalų, kuriuos ką tik matėme, yra daugybė kitų veiksnių, turinčių įtakos ląstelių gyvybingumui. Aplinkos sąlygos – temperatūra, pH, osmosinis slėgis, maistinių medžiagų prieinamumas ir O2 bei CO2 koncentracijos – yra labai svarbios. Daugumą šių kintamųjų valdo terpė ir jie priklauso nuo ląstelės tipo, o tai, deja, reiškia, kad negalime pateikti konkrečių gairių.
Kadangi ląstelės yra labai jautrios slėgiui, turėtumėte atkreipti dėmesį ne tik į aplinkos sąlygas, bet ir į savo skysčių tvarkymo būdus.
Paskutinis veiksnys, turintis įtakos ląstelių gyvybingumui, yra senėjimas. Dauguma baigtinių ląstelių linijų išgyvena 20–60 pasidalijimų prieš mirtį, o tai reiškia, kad jas galima pakartotinai panaudoti tik nuo 15 iki 45 kartų. Po to kriokonservuotą mėginį reikia atšildyti iš ląstelių banko. Nepertraukiamos ląstelių linijos gali daugintis neribotą laiką, tačiau kadangi jos yra linkusios į genetinį dreifą, jas reikia reguliariai keisti.
Ląstelių gyvybingumui matuoti gali būti naudojami aptikimo tyrimai, naudojant kolorimetrinius, fluorometrinius ir bioliuminescencinius metodus. Dažniausiai naudojamas kolorimetrinis metodas yra MTT metodas, pagrįstas geltonųjų tetrazolio druskų redukavimu į purpurinius formazano kristalus gyvomis ląstelėmis.
96-šulinėlių lėkštės
automatizavimas
Daugelį aukščiau aprašytų iššūkių galima išspręsti automatizavus ląstelių kultūros darbo eigą. Pavyzdžiui, ląstelių tvarkymas visada bus nuoseklus, o tai turės teigiamos įtakos atkuriamumui ir gyvybingumui. Svarbiausia, kad automatizavimas sumažina vartotojo užteršimo riziką.
Nepaisant šių pranašumų, automatizuoti visas darbo eigas gali būti sudėtinga dėl biudžeto priežasčių, vietos stokos robotams arba dėl to, kad nėra pakankamai išteklių automatizuoti ir patvirtinti kiekvieną veiksmą vienu metu. Bet tai gali būti išspręsta!
